Газовая хроматография

Жидкостная хроматография

Жидкостная хроматография (ЖХ) - способ (метод) хроматографического разделения в котором подвижной фазой является жидкость и разделяемые вещества находятся в постоянном равновесии между подвижной и неподвижной фазой. По типу неподвижной фазы различают: жидкостно-жидкостную, жидкостную-твердофазную и жидкостно-гелевую хроматографии (см. Рис Классификация по агрегатному составу фаз).

Сфер применения ЖХ почти так же много, как велико количество направлений человеческой деятельности, где необходимо изучить состав различных растворов или выделить какое-либо вещество из жидкости. Практически не заменима ЖХ при определении и фракционировании высокомолекулярных лабильных соединений биологического происхождения: нуклеиновых кислот и белков. По началу основным недостатком метода, по сравнению с ГХ, была его низкая разрешающая способность , обусловленная несколькими причинами: высокой вязкостью подвижных фаз, и, следовательно, низкой скоростью диффузии; неоднородностью подвижных фаз; ограничения в длине колонки и т.д. Но значительный прогресс в производстве высокоточных приборов (в первую очередь насосов), сорбентов и вычислительной техники привел к появлению метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сравнимого по числу теоретических тарелок с газовой хроматографией (N ~ 100000). Основным отличием ВЭЖХ от классической колоночной ЖХ является использование мелкодисперсных (<10 mkm) сорбентов на основе жестких матриц (зачастую из силикагеля) и высоких скоростей потока.

Сверхкритическая флюидная хроматография

 

Адсорбционная хроматография

В этом процессе неподвижная фаза представляет собой твердый сорбент. Равновесие процессов сорбции и десорбции в условиях, достаточно далеких от насыщения емкости сорбента, устанавливает­ся независимо для каждого компонента смеси веществ. Различие в коэффициентах адсорбции обусловливает разницу в распределении этих компонентов между сорбентом и подвижной жидкой фазой. Соответственно чем большим сродством к сорбенту обладает данный компонент смеси, тем медленнее он будет мигрировать вслед за элюен-том вдоль колонки или пластинки. Если сорбция происходит на наружной поверхности сплошных гранул, то имеет место адсорбцион­ная хроматография в чистом виде. Если же материал сорбента имеет пористую структуру и большая часть сорбирующей поверх­ности находится внутри его гранул, то в задержании молекул веще­ства в неподвижной фазе участвует еще и процесс их диффузии в неподвижной жидкости внутри пор, подобно тому как это имеет место при гель-фильтрации. Практически, впрочем, связывание вещества    за   счет   сорбции   доминирует.

Аффинная хроматография

Относительно слабое обратимое взаимодействие между молеку­лами биполимеров и сорбентом может осуществляться за счет сил биологического сродства. Такие силы действуют, например, между ферментом и его субстратом или ингибитором, антигеном и антите­лом, гормоном и рецептором и т. д. Для осуществления фракциони­рования по биологическому сродству, т. е. методом аффинной хро­матографии, один из «партнеров» такой пары химически закрепляют на матрице «биоаффинного» сорбента, а сорбцией и элюцией второго «партнера» управляют путем изменения условий биологического взаимодействия в результате введения в элюент солей, мочевины, детергентов, конкурирующих молекул или изменения его рН (см. рисунок).

В большинстве случаев имеет место не хроматографический процесс фракционирования   смеси веществ, а очистка одного из них путем избирательной сорбции, промывки и последующей десорбции. Впрочем, возможны варианты и истинной хроматографии, исполь­зующей явление аффинного взаимодействия. При этом фракциони­рованию подвергается смесь близко родственных биологических макромолекул, различающихся по своему сродству к одному тому же   аффинному   сорбенту.

Иногда явление биологического сродства используется только в процессе элюции. В этом случае вещество связывается с поверх­ностью твердого сорбента за счет ионного взаимодействия или сил адсорбции, а элюцию осуществляют путем увеличения его сродства к элюенту, куда вводят биологически родственные (в указанном выше смысле) молекулы. Такой процесс было бы точнее называть аффинной элюцией. Имеются примеры, когда один из партнеров аффинной пары имеет не биологическое происхождение, а представ­ляет собой, например, сложный краситель, пространственная конфи­гурация которого имитирует какую-либо биологическую структуру.

Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой из­бирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Не­редко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается лег­кой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице.

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугиро­вания и декантации.

Одной из разновидностью афинной хроматографии является металхелатная хроматография, основанная на образовании комплексов между нанесенным на сорбент ионом металла, например кадмия или никеля (никель-хелатная хроматография), и специфичеким линкером, обычно 6-10 остатков гистидина, химически связанным с целевым белком (Рис. 2). Особенно часто данный метод применяется при очистке генноинженерных белков, генетический код которых заклонирован в специально сконструированные плазмиды. В результате чего молекула белка экспрессируется с присоедененным полигистидиновым концом, за счет которого она специфичеки связывается ионом металла при нанесении на колонку, а примеси при этом не задерживаются, что позволяет достичь очень большой чистоты целевого продукта при минимальных затратах. Также, при необходимости возможно провести ренатурацию связанных с сорбентом белков (например обратным градиентом мочевины) после чего элюировать уже чистый биологически активный белок.

Рис. 2. Прикрепление белка с гистидиновой зацепкой к грануле в аффинной колонке. Около 10 гистидиновых остатков присоединены к белку с помощью генетической инженерии, например, сочетанием сайт-специфического мутагенеза с полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (см. Nolting, 1999b). Гистидиновые остатки прочно связываются с гранулами, сделанными из никель-хелатирующей смолы.

Также возможен несколько иной вариант аф­финной хроматографии, в котором неправильно свернутый белок с помощью шаперонов сворачивается правильным образом и элюируется буферным раствором (Рис. 3).

Рис. 3. Исправление свертывания дорогих, плохо сворачивающихся, белков: шапероны, называемые также шаперонинами, при­креплены к гранулам, и развернутый или неправильно свер­нутый белок пропускается сквозь колонку. Шаперон взаимо­действует с образцом белка и катализирует его сворачивание в правильной конформации.

Один из методов тестирования аффинных сорбентов приведен тут.

Гель-фильтрация

Переход молекул вещества из подвижной фазы в неподвижную и обратно за счет диффузии ничем не затруднен. Иная ситуация складывается внутри гранул. Здесь диффузия более или менее за­труднена из-за столкновений молекул диффундирующего вещества с нитями пространственной сетки полимера или стенками пор. Если размеры молекул соизмеримы со средним диаметром каналов в гранулах, то эти затруднения становятся весьма существенными и диффузия тормозится. Может сложиться и такое положение, когда часть внутреннего объема гранул, т. е. часть объема неподвиж­ной фазы (а иногда и весь этот объем), оказывается недоступной для молекул вещества,  растворенного   в  подвижной фазе.

Различие степени доступности объема неподвижной фазы для молекул различных компонентов исходной смеси веществ является фактором, определяющим возможность их фракционирования. Оче­видно, что оно будет происходить по размерам молекул (Рис. 1). Если в со­ставе смеси имеются очень крупные молекулы, вовсе не проникаю­щие внутрь гранул, то они будут выходить из колонки или достигать края хроматографической пластины вместе с передним фронтом подвиж­ной фазы («фронтом элюции»). В то же время мелкие молекулы, свободно диффундирующие внутрь гранул, часть времени будут находиться в неподвижной фазе. Статистически эта часть времени одинакова для всех молекул такого размера и зависит от соотношения объемов жидкости в неподвижной и подвижной фазах. Таким образом, все мелкие молекулы достигнут конца хроматографического пути более или менее одновременно и заведомо позднее, чем крупные. Молекулы промежуточных размеров, для которых из-за разброса значений еффективных диаметров пор внутри гранул неподвижной фазы до­ступна только часть ее объема, должны, очевидно, перемещаться вдоль  колонки или пластины с промежуточной скоростью.

Рис. 1. Гель-фильтрационная хроматография. Малые молекулы в об­разце могут проникать внутрь гранул, вследствие этого они протекают через колонку медленнее. Крупные молекулы, ко­торые не могут проникнуть в гранулы через поры, проходят сквозь колонку быстрее, чем более мелкие. Правильный раз­мер пор и свойства растворителя являются решающими для хорошего разделения.

Это явление первоначально было названо «гель-фильтрацией», поскольку в качестве пространственной сетки использовали поли­мерные гели. Однако эти гели относительно легко деформируются и для хроматографии при высоком давлении непригодны, поэтому их стали заменять жесткими материалами, в частности пористым стеклом и силикагелем. Иногда для этого варианта хроматографии вводят термин «эксклюзивная хроматография» («exclusion» — исклю­чение; имеется в виду исключение из гранул крупных молекул). Поскольку сейчас силикагель явно вытесняет пористое стекло, мы сохраним для рассматриваемого варианта хроматографии прежнее название — гель-фильтрация.

Очевидно, что размеры молекул связаны с их массами, но отнюдь не целиком ими определяются. Это особенно важно учитывать в случае макромолекул, размеры которых могут существенно зави­сеть от плотности упаковки полипептидной или полинуклеотидной цепи. В ограничении свободы диффузии через пространственную сетку пор внутри гранул немалую роль может играть и форма моле­кулы. Очевидно, что сферическая глобула будет диффундировать иначе, чем молекула такого же объема, но вытянутая в виде палочки.

Как во всех хроматографических разделениях излишняя длина колонки приводит к размыванию пика (Рис. 2).

Рис. 2. Уширение полос в колон­ке из-за чрезмерной длины колон­ки. Так называемая эффективная часть колонки является достаточной для разделения. Слишком длинные колонки не улучшают очистку, но вызывают разбавление образца из-за уширения полос.

  Рис.3. Молекулы с известной молекулярной массой дают возмож­ность оценить молекулярную массу неизвестной молекулы. В данном случае для исследуемой молекулы наблюдаются два пика, что указывает на равновесие мономер-димер.

Пористые материалы для гель-фильтрации чаще всего выпускают­ся в виде сферических гранул целого набора диаметров с различными средними размерами пор.

Ионообменная хроматография

Этот процесс сходен с адсорбционной хроматографией в следствии того, что задержание молекул вещества в неподвижной фазе обусловлено их связыванием с поверхностью твердого гидрофильного материала сплошных или пористых гранул, находящихся в контакте с жидким элюентом. Однако в этом варианте хроматографии задержание происходит не за счет молекулярной адсорбции, а в результате электростатиче­ского   взаимодействия   разноименно   заряженных   ионов.

На всех   наружных и внутренних поверхностях твердых гранул  вдоль нитей полимеров и гелей, образующих пространственную сетку, более или менее равномерно распределены ковалентно связан­ные с этими поверхностями ионогенные группы. В омывающем их водном элюенте они диссоциируют, образуя сетку одноименно заря­женных неподвижных ионов. Если молекулы компонентов фракци­онируемой смеси тоже способны ионизироваться при растворении, причем так, что их суммарный заряд имеет противоположный знак, то они связываются с неподвижными ионогенными группами силами электростатического взаимодействия, оказываясь тем самым фиксированными в неподвижной фазе. Связь эта обратима: ионы одних компонентов могут замещаться на другие или вытесняться находящимися в элюенте контрионами ионогенных групп сорбента, а также специально вводимыми для этой цели в элюент ионами. Происходит обмен ионов, поэтому сорбенты описанного типа называ­ют  ионообменниками (ионитами).

Выбор ионообменного сорбента  для очистки белка в зна­чительной степени зависит от изоэлектрической точки белка — pi. При значениях рН, превышающих pi белка, его молекулы приобретают в целом отрицательный заряд и способны адсорбироваться анионным обменником. При рН ниже pi белок будет адсорбироваться катион-ным обменником. Например, если pi = 4, то в большинстве случаев целесообразно подобрать сорбент, который способен связывать белок при рН > 4. Поскольку при рН > 4 такой белок заряжен отрицательно, то сорбент должен быть анионообменником, например, с диэтиламиноэтильной функциональной группой (ДЭАЭ). Можно было бы использовать рН < 4 и катионообменник, но многие белки в таких условиях нестабильны, либо образуют агрегаты. Если, напротив, белок, который мы хотим очистить, имеет pi = 10, то он будет заряжен поло­жительно в условиях, пригодных, как правило, для ионообменной хро­матографии, т. е. при рН около 7. Таким образом, в общем, для белка такого типа мы должны выбрать катионообменный сорбент, например, с карбоксиметильной функциональной группой (КМ), которая при нейтральном рН заряжена отрицательно.

Распределительная хроматография

           Строго говоря, так следует назвать хроматографическии процесс, в котором неподвижная и подвижная фазы представлены двумя несмешивающимися или частично смешивающимися жидкостями. Если в системе двух контактирующих между собой жидкостей такого рода растворять какое-либо вещество, то его концентрация в этих растворителях будет одинакова только в том случае, если оба они обладают одинаковой растворяющей способностью, т. е. одинаковым сродством к веществу. В противном случае молекулы вещества будут переходить из одной жидкости в другую до тех пор, пока не установится равновесие, которому будет отвечать более высокая концентрация этих молекул в той жидкости, растворяющая способность которой выше. Если такие жидкости представляют собой неподвижную и подвижную хроматографические фазы, то распределение вещества между фазами происходит в соответствии с растворимостями в них компонентов исходной смеси, причем для каждого компонента — независимо от всех других (если, разумеется, свойства самих растворителей при этом не изменяются). Чем выше сродство данного компонента к неподвижной фазе, тем медленнее он мигрирует вдоль колонки или пластинки.

         Жидкость неподвижной фазы, как и при гель-фильтрации, мо­жет быть просто иммобилизована внутри пористых гранул, или, например, быть прочно связана с волокнами набухшей целлюлозы, или же покрывать тонкой пленкой гранулы из сплошного материала и поверхность пор внутри них. Покрытие может осуществляться за счет смачивания, сорбции или химическим путем. В последнем случае нередко «пленка» жидкости сводится к мономолекулярному слою вещества, способного удерживать близ своей поверхности молекулы компонентов фракционируемой смеси в соответствии со степенью их сродства к нему. В этом случае о соотношении растворимостей говорить трудно, так что лучше оперировать только поня­тиями «сродства» того или иного компонента к неподвижной и под­вижной фазам, что, впрочем, с позиций теории хроматографии сведется к точно такой же, как при истинном растворении, количествен­ной характеристике равновесного распределения фракционируемого материала между двумя фазами. Если в процессе распределитель­ной хроматографии участвуют две истинные жидкости, то для осу­ществления равновесного распределения вещества они сами тоже должны быть в равновесии между собой, т. е. в случае частичной их растворимости друг в друге должны быть взаимно насыщенными.

         Очень часто одна из фаз обогащена органическим растворителем, в то время как другая является в основном водной. Естественно, что в этом случае фракционирование веществ идет по степени их гидрофобности. Исторически сложилось так, что «нормальным» расположением фаз называют такое, при котором неподвижной является водная фаза. За счет смачивания (набухания) она легко фиксируется на гидрофильных матрицах (целлюлозе, полиакриламидном или декстрановом гелях, диатомовых землях, силикагеле и др.). В состав подвижной фазы в этом случае входят органические растворители. При обратном расположении фаз, когда на твердой матрице фиксируют пленку органического растворителя, а подвиж­ная фаза представляет собой водный раствор, распределительную хроматографию называют хроматографией в обращенных фазах (ХОФ). В английской литературе ее обозначают RPC (reversed phase chromatography). ХОФ при высоком давлении нередко осущест­вляют таким образом, что неподвижная фаза вместо пленки органи­ческого растворителя представлена монослоем молекул жирного или ароматического ряда, химически закрепленных на поверхности твердой матрицы силикагеля. В качестве матриц для ХОФ с истин­но жидкой неподвижной фазой часто используют предварительно силиконированные   диатомовые   земли   типа   кизельгуров.