Полиакриламидный гель

Сефакрилы

Ультрагели типа АсА

Полистирольные смолы

Полиамидные смолы

Силикагель

Окись алюминия

Пористое стекло

Оксиапатит

Полиакриламидный гель

Нити линейного полимера акриламида, сши­тые N.N'-метиленбисакриламидом, образуют относительно жесткую и химически инертную пространственную сетку геля, хорошо удер­живающую воду. Пористость и жесткость геля определяется про­центным содержанием в нем полимера. Гранулированные матрицы полиакриламидного геля (ПААГ) используются только для гель-фильтрации. Рабочий диапазон рН — 3-8. Гель можно автоклавировать; он выдерживает контакт с разбавленными органическими кислотами. 8 М мочевиной, 6 М гуанпдинхлоридом,   детергентами.   В  отличие   от  агарозы ПААГ  «не боится» высушивания. Матрицы поставляются и виде сухих сферичес­ких гранул нескольких диапазонов диаметров в интервале от 40 до 300 мкм. При замачивании они сильно набухают и могут связывать, в зависимости от содержания ПААГ, от 3 до 30 мл воды на 1 г су­хих гранул.
Полиакриламидпые патрицы выпускают фирмы «Bio-Rad» (под общим названием «Bio-Gel P») и «Roanal» (под названием «Акрилекс»). На основе полиакриловой кислоты выпускают также ионообменники — «Trisacryl» (фирма  «LKI3») и «Bio-Rex 70» (фирма «Bio-Rad»).
В целях объединения достоинств описанных выше материалов было создано два новых типа комбинированных матриц — «Sephacryl» и «Ultrogel AcA».

Сефакрилы

Рис. 1 Структура полиэтиленбисакриламида.

Торговое название «Sephacryl» получила разработанная фирмой «Pharmacia» матрица для гель-фильтрации на основе декстрана и N,N'-метиленбисакриламида (Рис.1). В ней удачно сочетаются качества сефадексов и ПААГ — нити декстрана и полимерные нити метилеп-бисакриламида (он способен полимеризоваться в нити подобно акрил-амиду химически связаны друг с другом.
Структура полиэтиленбисэкрила.иида Получается очень жесткий гель, пористость которого легко контро­лировать. Он гидрофилен, химически инертен, выдерживает контакт с 8 М мочевиной, 6 М гуанидинхлоридом, детергентами и органиче­скими растворителями; его можно автоклавировать при 120^oС. Рабо­чий диапазон рН — 2-11. Благодаря своей жесткости сефакрил мо­жет быть использован при значительно больших скоростях элюции, чем сефадекс с такой же пористостью. Адсорбция здесь несколько более заметна, чем у сефадексов, особенно при кислых значениях рН (ее подавляет 0,05 М NaCl). Сефакрил поставляется в виде сус­пензии набухших гранул с размерами 40—105 мкм.

Ультрагели типа АсА

«Ultrogel AcA» — еще один вариант жесткой матрицы, обеспечи­вающей широкие возможности выбора размера пор. Здесь контроли­руемая пористость ПААГ сочетается с жесткостью агарозы — сетка ПААГ полимеризуется внутри жесткого каркаса агарозы. Химичес
кой связи между ними нет, но агароза придает жесткость сфери­ческим гранулам ультрогеля, в то время как их пористость опреде­ляет ПААГ. По химической и термической стойкости эта матрица сходна с агарозой; диапазон диаметров гранул — 60—140 мкм. Мат­рицы типа «Ultrogel AcA» с различным содержанием агарозы и ПААГ в виде водных суспензий поставляют фирмы «LKB» и «113F». Эти матрицы нашли применение не только для гель-филь­трации, но и для синтеза аффинных сорбентов на их основе.

Полистирольные смолы
 

Нити линейного полимера полистирола, химически «сшитые» мо­лекулами дивинилбеизола в жесткую пространственную сетку (Рис.2), вы­пускаются в виде сухих сферических гранул под торговым названием «смол» («resins»).

Рис. 2 Структура полистирола

Содержание дивинилбензола варьирует от 2 до 12%, определяя сред­ние размеры пор сетки. Эти ра^геры обычно малы, так что внутрен­ний объем гранул полистирола доступен только для низкомолеку­лярных соединений (иуклеотидов, аминокислот, коротких пептидов и др.). Впрочем, имеются и «макроретикулярные» типы смол на осно­ве полистирола; при их изготовлении микрогранулы смолы спе­каются в гранулы обычных размеров (30—300 мкм). Внутренний объем таких гранул, представленный свободным пространством, остающимся между микрогранулами, доступен для биологических макромолекул.
Немодифицированные полистиролыше смолы гидрофобвы. Моди­фикация осуществляется присоединением ионогенных групп по остат­кам бензола в пара-положении. Это придает смоле в целом гидро-фильность, хотя возможность и склонность к гидрофобным взаимо­действиям с фракционируемым материалом сохраняется. Для хрома­тографии компонентов белков и нуклеиновых кислот в водных элю-ентах смолы на основе полистирола применяются только в качестве матриц ионообменников. Благодаря частоте расположения в про­странстве остатков бензола эти матрицы отличаются высоким содер­жанием ионогенных групп. Химически они очень устойчивы (можно промывать 4 н. НС1 и 2 н, NaOH) и выдерживают нагревание до 120°C. При замачивании гранулы набухают, связывая (в зависимости от пористости) от 1 до 3 мл воды на 1 г сухой смолы. Макроретнкуляр-ные ионообмешшки на основе полистирола можно, вообще говоря, использовать для хроматографии белков, но при этом следует опа­саться денатурации за счет гидрофобных взаимодействий белковых глобул с материалом матрицы. Для липофильных белков мембран такое взаимодействие, по-видимому, опасности не представляет.
Наиболее популярные ионообменники на основе полистирола вы­пускаются под торговыми названиями «Dowex» (фирма «Dow Che­mical Со») и «Amberlyte» (фирма «Rohm and Haas») и перепродаются большинством фирм, торгующих биохимическими реактивами. Хоро­ню промытые и отсеянные обменники тина «Dowex» для аналитичес­ких целей поставляет фирма «Bio-Rad» под наименованием «Bio-Rad AG». Повышенные требования, предъявляемые к ионообменникам для современных аминокислотных анализаторов, привели к разра­ботке специальных полистирольных смол («Aminex», «Durrum» и др.) с малым разбросом размеров около номинальных значений порядка 10—20 мкм. Для высокоэффективной хро.матографии при высоких давлениях (ЖХВД) производят так называемые «пленочные ионо-обменники, у которых пленка полистпрольной смолы толщиной около 1 мкм фиксирована на поверхности стеклянных шариков диаметром 4 мкм («Whatman-Pellionex»).
 

Полиамидные смолы

Название «полиамиды» объединяет группу различных гетероцеп-ных полимеров, содержащих повторяющуюся амидную группу —СО—NН—. Они могут быть получены путем гомополиконденсации аминокарбоновых кислот (например, е-аминокапроновой кислоты), иногда с образованием лактамов (найлон-6, капрон). Амидные груп­пы обеспечивают в целом достаточную степень гидрофпльности поли­мера, но и гидрофобные свойства могут быть выражены, причем тем заметнее, чем длиннее углеводородная цепочка исходной аминокарбоновой кислоты. Полиамидные смолы используют главным образом для тонкослойной хроматографии. Они выпускаются в виде порошков или готовых пластинок для ТСХ с полиамидным покрытием. Для целей ЖХВД фирма «Whatman» поставляет готовые хроматографические колонки с пле­ночным адсорбентом «Pellarnidmi», у которого на стеклянных бусах фиксирована пленка найлона-6.

Силикагель

Матрицы и сорбенты на основе силикагеля получили в последние годы очень широкое распространение, особенно для ЖХВД. Бур­ное развитие ЖХВД, особенно в качестве экспресс-метода техно­логического контроля в пищевой, фармакологической и многих об­ластях химической промышленности, а также в клинике, привело к появлению большого числа специализированной аппаратуры и еще большего количества торговых наименований силикагелей для хро­матографии. Ниже мы приведем их далеко не полный список, кото­рый позволит читателю ориентироваться в этом многообразии. Но сначала следует описать общие свойства силпкагельных матриц и вариантов их модификации, поскольку, по-видимому, в ближайшие годы область применения силикагелей расширится за пределы сферы анализа смесей относительно низкомолекулярных соединений на хроматографию белков, нуклеиновых кислот и других биополимеров при умеренных давлениях.

Силикагель («silica gel», «silica») — это аморфное вещество с об­щей химической формулой SiO₂*H2O. Закислением раствора силика­та натрия получают золь ортокремневой кислоты (SiO₂*2H₂O), затем его «состаривают», промывают и сушат. В процессе «старения» золя идет его поликонденсация в микрочастицы, которые затем образуют конгломераты, пронизанные капиллярами (порами) со средним ли­нейным размером в пределах 3—30 нм. Удельная поверхность си­ликагелей может достигать очень больших значений — порядка 600 м2/г. В зависимости от технологии приготовления можно полу­чить различные размеры микрочастиц и пор между ними. От нее весьма существенно зависит и разброс этих размеров, а также по­верхностные свойства материала, что весьма существенно влияет на хроматографическио характеристики матриц. Поэтому не удивительно, что силикагелн различных марок, имеющие, согласно фирменным данным, как будто одинаковые параметры, по-разиому проявляют себя в хроматографнческом процессе.

Атомы кислорода находятся в вершинах тетраэдра, что обусловлива­ет более сложную пространственную структуру микрочастиц. Однако сейчас представляют интерес две особенности этой схемы, очевидно, сохраняющиеся и при построении пространственной систе­мы. Во-первых, атомы кремния жестко связаны между собой кисло­родными мостиками; во-вторых, на поверхности микрочастиц, а сле­довательно, в порах и на поверхности гранул силикагеля должны в большом количестве находиться силанольные группы — связанные с кремнием гидроксилы. В результате последнего обстоятельства силикагель очень гидрофилен: силанольные группы охотно образу­ют водородные связи с молекулами воды. Общеизвестно, что силика­гель широко используется в качестве осушителя; по этой же причи­не  он  является прекрасным  сорбентом.

Увлажненный силикагель регенерируют и активируют при тем­пературе 200—400°С. Результаты процесса зависят от выбора темпе­ратуры в этом диапазоне. Прогревание при 150^оС ведет к постепенной утрате силикагелем физически связанной (сорбированной) воды, и сорбцнонная способность его увеличивается. В интервале 450—250^оС она остается практически неизменной. Нагревание в ин­тервале 250—400°С приводит к отнятию химически связанной воды от наиболее реактивных силанольных групп. Сорбционная способность снижается, но становится более однородной по всей поверхности си­ликагеля. Выше 400°С потеря воды связана с образованием силоксановых мостиков между соседними силанолами, и сорбционная способ­ность падает необратимо. Для получения стандартной адсорбцион­ной способности силикагель после полного высушивания частично дезактивируют, добавляя дозированное количество воды (20—30 мл на 100 м² общей поверхности). Такой силикагель, сохраняя гидрофильность и высокую адсорбционную способность, практически не связывает воду из атмосферы. Покрытые им пластинки для ТСХ и сорбенты для адсорбционной хроматографии можно длительно хра­нить, но, разумеется, не в слишком влажном воздухе.

Немодифицированный силикагель достаточно инертен, хотя сле­дует помнить, что силанольные группы делают его поверхность слегка кислой. Рабочий диапазон рН для таких силикагелей лежит в нейтральной и кислой областях (рН 3—8). В щелочной среде силикагель приобретает химическую активность, но вместе с тем постепен­но  разрушается   (растворяется) водой.

 До сих пор в большинстве случаев силикагель для ЖХВД вы­пускается в виде гранул неправильной формы. Некоторые фирмы осво­или производство сферических гранул. Один из вариантов техноло­гии, пригодной для этой цели, состоит в получении органических полимеров сферической формы, в которые оказываются погружены коллоидные частицы силикагеля. При высокой температуре полимер выжигают, получая таким образом пористые сферические гранулы, образованные спекшимися микрочастицами  силикагеля.

Химическая модификация силикагеля производится по тем же силанольным группам. Его пористая структура при этом сохраняет­ся. Модификация гл1п;ерилпрогшлсилапом лишает силнкагель ад­сорбционной способности, сохраняя гидрофильность; такая матрица удобна для гель-фильтрации. Модификация алифатическим л цепями различной длины (диметилсилап, октилсилан. октадецилсилан) или присадка фенильного остатка дают возможность получить матрицы для ХОФ (в реакцию модификации иногда вводят ди- или трихлор-силаповые производные радикалов). Введение полярных групп, на­пример — CN, —NO₂, —NH₂, —N(CH₃)₂. позволяет получить обменники для нормальнофазовой распределительной хроматографии, (НРХ), а введение неполярных - обменники для обращеннофазовой распределительной хроматографии, (ОФХ). Присадкой ионогенных групп получают ионообменники обоих типов (как правило, сильные). Наконец, как уже упоминалось, немодифицированный спликагель используют для адсорбционной хро­матографии. Таким образом, матрицы на основе силикагеля служат для ЖХВД почти во всем диапазоне хроматографических методов, за исключением лить афинной хроматографии. Остается добавить, что, кроме пористых гранул, модифицированные силикагели приме­няют и для создания матриц пленочного типа, когда стеклянные ша­рики диаметром 30—40 мкм покрывают пористой пленкой силикагеля толщиной около 1 мкм. Ввиду краткости пути диффузии вещест­ва пленочные сорбенты позволяют проводить хроматографический процесс с очень большой скоростью, хотя их емкость, естественно, невелика.

Окись алюминия

Окись алюминия для хроматографических целей («Alumina») по­лучают в результате термического дегидрирования (при 400°С) гид­роокиси алюминия, осажденной в виде золя из раствора алюмината натрия. Ее подвергают старению, в процессе которого образуются прочные пористые конгломераты с удельной поверхностью до 200 м2/г. В зависимости от характера обработки эта поверхность в водной среде проявляет слегка кислые или щелочные свойства или же остается нейтральной. Препарат одной из кристаллических форм окиси алюминия под названием «Alumina CY» поставляется многими фирмами, выпускающими биохимические реактивы, в виде 5—20%-ной взвеси в воде. Он используется для адсорбционного фракциони­рования белков в объеме. Имеются в продаже также и сухие гранулы размером 5 мкм и выше с порами диаметром 60—150 A («BDH», «Bio-Bad»,   «Sigma»).

Окись алюминия используют для ТСХ (часто в виде готовых пластинок) и для колоночной адсорбционной хроматографии. Для ЖХВД в щелочной среде (где силикагель непригоден) также исполь­зуют матрицы на основе окиси алюминия — как сплошь пористые («Merck», «LiChrosorb», «Alox T»), так и пленочного типа («Whatman», «Pellumina»).

Пористое стекло

Путем специальной обработки щелочно-боросиликатного стекла и последующей экстракции растворимого материала удается полу­чить стеклянные шарики с хорошо контролируемым размером пор — типа CPG-10 («controlled pore glass»). В качестве матриц для гель-фильтрации они привлекательны своей жесткостью, химической инертностью и жаростойкостью (при стерилизации). Однако следует иметь в виду, что их поверхность несет небольшой отрицательный заряд и может сорбировать, а иногда и денатурировать белки. По­ристое стекло, ассортимент которого включает 11 размеров пор (от 75 до 3000 А) и два, три или четыре диапазона диаметров шариков (от 20 до 400 МЕТИ), поставляется фирмами «BDH» («Glass granules CPG-10»), «Serva» («CPG-10») и «Sigma» («PG»). Последние две фирмы производят также пористое стекло, у которого поверхностный заряд блокирован химической присадкой глицеридов: «CPG-10 Polyol» («Serva») и «GG» («Glyceryl glass»; «Sigma»).

Оксиапатит

Как известно, фосфат кальция (брушит; СаHРО₄*2Н₂О) в воде нерастворим, но может давать суспензию очень мелких кристаллов (размером около 30 мкм), обладающих высокой адсорбционной спо­собностью. Его получают, сливая растворы СаСl₂ и NaH₂PO₄. При рН >7 брушит постепенно превращается в оксиапатит, который можно представить брутто-формулой Са₅(РО₄)ОН. Это превращение можно ускорить обработкой щелочью. Из суспензии оксиапатит можно отделить и вы­сушить после промывки этанолом; и ацетоном. Кристаллы окснапа-тпта хрупки и легко крошатся, поэтому он требует осторожного обращения (в частности, нельзя допускать замерзания суспензии оксиапатита). Заполненные им колонки плохо «текут», поэтому приходит­ся работать с   широкими и короткими колонками. Оксиапатит используется в качестве сорбента для белков и нуклеи­новых кислот. Основную роль в адсорбционном взаимодействии, по-видимому, играют ионы Са+, находящиеся на поверхности кристал­лов. 1 г оксиапатита может сорбировать около 10 мг белка или 1 мг ДНК. Десорбцию ведут фосфатным буфером, а в некоторых случаях — раствором соли. Оксиапатит поставляется в виде суспен­зии в разбавленном Nа-фосфатном буфере или в виде порошка.